10.1 Métodos de purificación y análisis de los ácidos nucleicos.

OBTENCIÓN DE ADN Y SEPARACIÓN DE FRAGMENTOS DE ADN. 

 La primera técnica que todas las demás necesitan es la extracción del ADN, y para ello es necesario purificarlo desde cualquier tejido aunque usualmente se hace a partir de sangre. Se basa en una serie de lavados de la muestra y agregado de proteinasas que eliminan las proteínas del medio, detergentes para elminar las membranas plasmáticas y luego ir purificando el ADN de esa mezcla de ARN proteínas y restos celulares.

 

 

 Así se ve el ADN recíen extraído en alcohol.

Para poder visualizar el ADN debemos recurrir a los geles de Agarosa. Una vez extraído el ADN o hecha una reacción de PCR debemos verificar que el ADN está allí.

Para eso debemos prepar un gel de agarosa, con una serie de pocillos donde colocar las muestras que sumergidas en el gel y este en un buffer conductor, como el ADN tiene carga negativa migrará hacia el polo positivo si le hacemos pasar una corriente eléctrica.

 

Una vez conocida la concentración del ADN, éste será utilizado básicamente con el propósito de amplificar determinadas secuencias del mismo mediante PCR. 

En ciertos casos la simple detección del fragmento amplificado tiene valor diagnóstico por sí mismo. La metodología empleada para la detección puede ser: 

1.      separación y visualización de dicho fragmento en geles adecuados de agarosa o poliacrilamida (Ej. detección de infección por virus de la hepatitis, SIDA, HPV oncogénicos...). En otros casos el valor diagnóstico se obtiene por comparación de la movilidad del fragmento en un gel, respecto a un fragmento de características conocidas (Ej. movilidad de un exon mutado del gen supresor p53 en relación al mismo exon normal...), o bien, 

2.      detección del fragmento amplificado mediante ELISA con revelado colorimétrico o quimioluminiscente.

 

Por el contrario, en otros casos el valor diagnóstico se alcanza una vez que el fragmento amplificado se analiza mediante cualquiera de las siguientes técnicas:

 

1.      Corte con enzimas de restricción. Los fragmentos generados en la restricción se separan en geles de agarosa o poliacrilamida adecuados (Ej. Tipificación HPV, genotipado ApoE...). 

2.      Hibridación.  Los fragmentos generados en el PCR se separan en  gel de agarosa, se transfieren a un soporte adecuado (nitrocelulosa, nylon), y finalmente se hibridan con un ADN sonda marcado (Ej. Tipificación de los genes HLA Clase II...).

3.      Secuenciación.  Los fragmentos generados durante la reacción de secuenciación se separan en geles desnaturalizantes de poliacrilamida (Ej. Secuenciación de genes mitocondriales mutados implicados en ciertas enfermedades...).

 BIBLIOGRAFIA

 http://genmolecular.wordpress.com/tecnicas-de-biologia-molecular/